Микроустройства для фотонной печати внутри живых клеток

Двухфотонная полимеризация переместилась из области «на клетках» в область «внутри клеток», открывая новые, удивительные горизонты.

Двухфотонная полимеризация (ДФП) — один из самых эффективных инструментов микропроизводства, сегодня широко используемый для создания микрооптики, фотонных компонентов и биомедицинских каркасов с размерами элементов значительно меньше микрона. В основе этой технологии лежит использование фемтосекундного лазера для запуска полимеризации только в фокальном вокселе, что позволяет создавать сложные самоподдерживающиеся структуры без обычных послойных ограничений, характерных для крупномасштабных аддитивных процессов.

Биосовместимый ТПП в основном использовался вне клеток: для печати каркасов для роста клеток, гидрогелей со встроенными клетками или структур в тканеподобной среде. Были даже продемонстрированы возможности печати, аналогичные тем, что используются in vivo, внутри небольших живых организмов, и, по крайней мере, одно сообщение о печати внутри синтетической клетки. Однако фактическое изготовление внутри живой клетки млекопитающих до сих пор не проводилось, главным образом потому, что для этого необходим фоторезист, который клетка может выдерживать как до, так и после полимеризации.

Именно эту проблему пытаются решить исследователи из Института им. Й. Стефана и Люблянского университета, которые сообщают о прямой 3D-печати микроструктур внутри живых клеток HeLa. Их главный трюк заключается в том, чтобы ввести крошечную каплю фоторезиста в клетку, затем полимеризовать только нужные части, а остальное позволить раствориться.

Печать в цитозоле с использованием коммерческой платформы TPP.

Команда исследователей ввела микроинъекцию капли негативного фоторезиста в живые клетки HeLa, а затем использовала коммерческую систему Nanoscribe (Photonic Professional GT2) с фемтосекундным лазером с длиной волны 780 нм для нанесения заданного рисунка внутри капли. Поскольку ближний инфракрасный свет проходит через клетку и среду с минимальным поглощением, полимеризация происходит только в точке интенсивного фокуса, создавая твердую микроструктуру, оставляя окружающую цитоплазму практически нетронутой.

Выбор материала был решающим этапом. Авторы выбрали Nanoscribe IP S, поскольку он, по-видимому, относительно хорошо переносится клетками даже до полимеризации, и он слабо растворим в воде, поэтому неполимеризованная смола может медленно растворяться. Такая растворимость означает наличие практического временного окна: у операторов обычно было от одного до двух часов после инъекции для завершения печати, в зависимости от размера капель.

Внутри капель диаметром от десяти до пятнадцати микрон они печатали объекты размером около десяти микрон, включая крошечного слона размером 10 мкм, множество отдельных структур внутри одной клетки и даже простые логотипы. Сама лазерная печать происходит быстро: изготовление объекта размером в десять микрон занимало примерно от трех до десяти секунд, в зависимости от объема. При таком масштабе вязкость смолы и короткое время экспозиции означали, что структура не смещалась во время печати, поэтому им не требовались опоры.

Разрешение, искажение и реальность капельной оптики

Печать внутри капли, внедренной в цитоплазму, звучит как оптический кошмар, поскольку несоответствие показателей преломления может смещать фокус и размывать воксель. Показатель преломления в жидкой форме составляет около 1,48, тогда как в цитоплазме он ближе к 1,36–1,39, поэтому преломление на границе капли неизбежно.

Команда смоделировала эффект с помощью моделирования лучевой оптики и обнаружила, что смещение фокуса остается небольшим, достигая примерно 0,5 мкм вблизи края капли. Расфокусировка оставалась ниже дифракционного предела в 400 нм более чем в девяноста процентах объема капли, что подразумевает, что большая часть области, пригодной для печати, ведет себя близко к условиям «объемного фоторезиста».

Они подтвердили это с помощью сканирующей электронной микроскопии отпечатков, сделанных в каплях (вне клеток, но в растворе с согласованным показателем преломления). Тестовая структура в виде кучи дров показала стенки толщиной всего 260 нм на сетке приблизительно 0,8 мкм. Поперечные сечения слона, напечатанного внутри клетки, показали плотную структуру без явной пористости в масштабе 100 нм.

С механической точки зрения, напечатанный полимер IP S обладает высокой жесткостью для клеточной среды, с модулем Юнга около 2,1 ГПа, поэтому даже тонкие элементы сохраняли жесткость во время миграции и деления клеток.

Здоровье клеток, сроки деления и стоимость внутриклеточного производства.

Встраивание твердого объекта в живую клетку никогда не будет «бесплатным», и исследование не делает вид, что это не так. Авторы наблюдали, что клетки, содержащие крупные напечатанные объекты, демонстрировали деформированную внутреннюю организацию, при этом ядро ​​меняло форму вокруг структуры. Это не удивительно, но важно: такой подход позволяет целенаправленно изменять механику клетки путем добавления жесткого включения там, где биология его не предусмотрела.

При количественной оценке времени деления было установлено, что клетки с крупными напечатанными структурами (более пяти микрон) делились дольше, обычно с задержкой примерно в один час, а иногда и на несколько часов. Клетки с мелкими напечатанными структурами (менее трех микрон) вели себя скорее как контрольные образцы. Другими словами, внутриклеточная печать может изменять фенотип исключительно за счет грубой силы геометрии.

Показатели жизнеспособности были невысокими. Через двадцать четыре часа в контрольных образцах без манипуляций наблюдалось около десяти процентов нежизнеспособных клеток при типичных условиях обращения. Одна только микроинъекция повысила нежизнеспособность примерно до пятидесяти процентов, инъекция капель силиконового масла — примерно до сорока четырех процентов, а состояние напечатанной структуры — примерно до пятидесяти пяти процентов. Вывод очевиден: проникновение через мембрану и механика добавления капли, вероятно, являются основными источниками повреждений, в то время как токсичность смолы и освещение могут быть второстепенными факторами.

Очевидно, что такой подход сопряжен со многими трудностями, однако исследователям удалось успешно осуществить 3D-печать внутри живых клеток. По крайней мере, тех, которые выжили.

По вопросам 3d печати, 3d сканированию, обучению в Краснодаре писать сюда:

телеграм — https://t.me/fidller

max — https://max.ru/u/f9LHodD0cOIGiBB1zqbYHFbw7XCslKRI5o6aikK4IGNDZtFio4aCgGJ1gUQ

почта — shope@fidller.com

все о кино тут — https://news.fidller.com
наш магазин — https://fidller.com
мы в телеграм — https://t.me/fidller_com
группа 3д печати — https://vk.com/3d_krd_123
https://t.me/pechat3dkrd